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酵素抑制剂:挑战高抑制强度与高选择性
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林俊宏研究员、何静玟博士班学生(中研院生物化学研究所)



酶,又称為酵素,是指具有催化功能的蛋白质,在生物体中是具有催化新陈代谢及生合成(biosynthesis)反应的蛋白分子;生物体藉著种种酵素的催化作用与调节,才能有效地完成所需要的许多生理活动。若细胞内的酵素活动受到抑制或干扰,整个生物体就可能出现异状,所以酵素往往成為开发药物的重要目标。近年来针对酵素开发的药物,如克流感(Tamiflu)就是治疗流行性感冒病毒的药物,属於病毒的唾液酸水解酶(Neuraminidase)的抑制剂(Inhibitor)。我们的研究团队近年来所研发的新技术,可以快速找到酵素的最佳抑制剂;此技术已成功应用到醣类水解酶中,找到抑制强度最高的分子,它的抑制常数(Inhibition constant: Ki)达到0.46 pM。醣类水解酶(Glycoside hydrolases),是一种专门水解糖苷键(Glycosidic bond)的酵素,是自然界中常见的酵素之一,生物体中此类酵素通常扮演代谢与调节的重要角色。 相同的醣水解酶存在於人体的不同区域,甚至同一细胞的不同胞器(Organelle)内,会有不同的角色与功能,另外,也有不同的醣水解酶,即使彼此角色功能不同,但所辨视的受质(Substrate)却相近。所以在开发抑制剂时,绝大部分的化合物对於类似或同类酵素均会產生多重的抑制行為,使得研究细胞和生物体的专一酵素的生理角色受到限制,因為这些抑制剂将会引起复杂的表徵(Phenotypes)。所以针对单一酵素开发具有高强度兼具高选择性的抑制物,是目前药物研发中的最重要的课题,可以减低对其他相似的酵素產生抑制,减少或去除不必要的副作用。



我们在数年前首先针对岩藻醣苷水解酶(α-L-Fucosidase, EC 3.2.1.51)进行研究,此酵素是负责催化水解反应以释放出岩藻糖(α-L-Fucose),而所辨视的岩藻糖大部分会透过各种不同的键结方式如α-1,2,α-1,3,α-1,4,α-1,6 与半乳糖( Galactose )或是 N- 乙醯葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)形成键结,这些具有岩藻糖修饰的醣类分子具有各种不同的生理活性,例如人体中A, B, H, 及 Lewis 抗原的非还原端常常含有岩藻糖修饰,而这些抗原则是血型分类的重要办识指标。除此之外,岩藻糖还涉及植物本身的防御、人体发炎反应、细胞凋亡(Apoptosis)、癌症肿瘤的转移以及人类基因遗传疾病Fucosidosis。


我们研发的方法是利用酵素的催化反应中的过渡态(Transition state)為主体,设计并合成它的类似构造。而醣水解酶抑制剂的主体开发即是将糖分子的氧环修改成氮糖分子(azasugar)為主体,接著再以组合式合成(Combinatorial synthesis)由环外与各种官能基结合造成多元性的组合。我们所发展的化学反应因选择性及產率很高,可直接在微盘(Microtiter plate)上进行。反应后的產物不必经由纯化步骤,可以直接以大量连续式的稀释,降低溶剂干扰后,后续的酵素活性测试也可以继续在微盘上进行(图一)。




此技术的开发可以免除传统作法上繁琐的纯化步骤,在极短的时间内可以完成眾多化合物的合成,以及后续酵素活性的筛选,找出最强的抑制剂,因此研发的费用与时间都可以降到最低。整个程序可在几小时或几天内完成,比起传统的作法省下许多宝贵的时间。这个方法所找到的分子往往专一性极高,不容易对其他类似的酵素產生抑制效果,在药物研发上亦可避免副作用的发生。此外,这种方法也可以找到紧密结合型抑制剂(Slow, tight-binding inhibitors),藉著额外延伸性的基团与标的酵素(Target enzyme)產生构形改变(Conformational change),而有更紧密的结合,因而使结合强度增加数千、万倍。



另一方面,我们最近几年与王惠钧副院长的结构生物学实验室合作,在与疾病相关联的酵素抑制物研发上,有不错的研究成果发表。与胃部疾病习习相关的幽门螺旋桿菌,它的岩藻糖合成转移酶(Fucosyltransferase)所催化的反应,是產生路易士抗原的生合成的关键步骤。我们已成功地解析出第一个X-ray结晶绕射结构用蛋白质结构推断出催化的反应机构,并成功地发展出酵素抑制剂。另外在与抗寄生虫疾病药物相关的酵素:麩胱甘肽—精胺质合成酵素,我们则是利用酵素与抑制物的结构讯息,发现特殊的反应机构,并指出未来药物设计与开发的新方向。



我们最近成功针对己醣胺水解酶(Hexosaminidase)开发高选择性的抑制剂,此酵素是主要降解糖胺聚醣(Glycosyaminoglycan)的醣水解酵素,可由软骨细胞分泌到细胞外作用,在关节炎病人的关节组织液中是主要的醣水解酵素。过去已有报导,抑制此酵素可以避免或甚至回復软骨降解的程度。另外,己醣胺水解酶也与溶酶体累积病变(Lysosomal storage disease)中的 GM2 神经节苷脂储积症有关,例如泰–歇克斯症和山德霍夫症(Tay-Sachs and Sandhoff disease)是因為形成己醣胺酶的基因突变,导致此酵素的代谢功能丧失。酵素抑制剂目前已知可增加这类缺陷酵素的稳定性,可以维持这些酵素代谢功能的最低程度,这样的概念称為 Pharmacological chaperones。因為己醣胺酶和葡萄胺醣水解酶(O-GlcNAcase)都是催化水解 N-乙醯葡萄糖胺的反应,两个酵素都拥有一样的催化机制。為了要开发这一类药物并降低副作用,建立具有选择性和高强度的抑制剂是现今阶段的重点。我们最近针对己醣胺酶抑制的研发,最好的抑制强度可以到达 0.69 nM,而且对於 O-GlcNAcase 的选择性可以高达1.9 × 105倍。这项突破性的研究成果希望能进一步发展出针对关节炎的新型用药。



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