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梁博煌（中研院生化所副研究员）


病毒的研究在台湾虽有相当的基础，但其研究的方向较偏重於临床案例、病毒的流行病学及病理的分子机制等，较少著重化学生物学（Chemical Biology）层面的药物合成与测试，以致病毒疾病的用药仍由大药厂开发，并取得专利权行销全世界。事实上，药物的开发在技术层面并非全由药厂掌握，学术界发展出来的独特技术亦相当关键，因此在先进国家常有学术界的教授，因获得有利用价值的发现，而自行开创新公司。但是药物的研发需要庞大资金，失败率高，恐怕只有药厂才有办法完成最后药物的开发，故学术界的发现最后均可能被药厂收购。当然如能因此药物而救人，也是功不可没。总而言之，由学界来当火车头推动药物研发，是很合理且值得，无怪乎每年都有许多和药物研发相关的国际研讨会，显示学术界及工业界对於药物研发相关资讯的渴望。



有关药物研发的科学期刊也愈来愈多，最著名的《Nature》有《Nature Biotechnology》、《Nature Medicine》及《Nature Review Drug Discovery》外，最近也出刊《Nature Chemical Biology》刊载关於化合物可影响生命现象的报告。Chemical Biology是用化学的方法来研究生命现象，范畴包括生物有机化学、生物无机化学、生物分析化学及生物物理化学等生物化学，有别於细胞生物学、发育生物学、分子生物学等生物学。事实上，生物学及化学在药物研发上是同等重要，也需先有对疾病分子机制的瞭解，例如发现產生突变的基因，使得表现的蛋白活性和正常不同，才能对症找药，以 Chemical Biology的方法发现药物，最后测试药物的活性。而在使用化学的方法来研究药物时，所需要的技术為针对疾病相关酵素之活性及反应机制作研究，以发展出测试活性的方法，并依此筛选化合物库来取得候选药物。另一方式是利用解析酵素三级结构，接著以结构為基础来设计药物；以电脑软体為辅，设计并合成酵素抑制剂，并在体外或细胞内测试其效能，这时可以再将抑制剂和酵素共结晶，依其结构修饰抑制剂结构，以便合成更佳候选药物。候选药物在通过动物活体及人体的测试后，才能寻求政府药物管理机关的认证而成為药品。



以 SARS 药物研发為例， SARS 於 2002 年底在中国大陆广东省发生，2003 年传播到全球 20 几个国家，造成 8千多个病例，约 8百人死亡。台湾也因有人受感染而造成人心惶惶，政府也啟动紧急应变措施，由国科会拨专款研究 SARS；由本院赖明詔副院长及台大陈定信院长担任总指挥，组成国内各个实验室之团队，在对抗 SARS的各个层面上努力。药物研发也在本院基因体中心翁啟惠主任的召集下，由该中心、化学所及生化所一些具Chemical Biology研究专长的实验室组成研究团队，本实验室也為其中一员，参加以 SARS蛋白酶為目标的药物研发。蛋白酶酵素在 SARS病毒复製过程中，扮演非常重要的角色，其功能為在病毒侵入人体后，生成多胜肽上切割 11 个定点而使一些重要酵素变成有活性的成熟酵素。这些酵素包括蛋白酶本身、helicase、RdRp（RNA-dependent RNA polymerase）及一些未知功能的蛋白。而 RdRp对於稍后病毒 RNA的复製，最后產生病毒外部结构蛋白很重要，所以蛋白酶对於整体病毒复製為必要的催化，若能发现其抑制物，可能可发展成為杀死病毒的药物。



根据其它类似的 3C 蛋白酶研究，SARS 蛋白酶為一类似 chymotrpsin 的蛋白酶，但不同於 chymotrpsin 使用Ser、His、Asp三个重要氨基酸，SARS蛋白酶使用 Cys、His催化水解反应，因此病毒也称為 3C-like（3CL）蛋白酶。因為 SARS 病毒还有另一个蛋白酶称為 papain-like 蛋白酶，所以 3CL 蛋白酶又称主要蛋白酶（main protease）。我们首先用大肠桿菌来表达此 SARS的主要蛋白酶，并设计萤光胜肽基质，将胜肽两端接上萤光团，一端是发出萤光的 Edans，一端是吸收萤光的 Dabcyl，当蛋白酶切断胜肽，两端為之远离而萤光上昇，而当有抑制剂存在时，蛋白酶活性减低，萤光上昇的速度减缓；由此萤光的高灵敏度变化，便可藉以寻找蛋白酶的抑制物，成為对抗 SARS 的可能药物。我们也对此蛋白的反应速率常数及蛋白是否形成具有活性的体（dimer）加以探讨。之后国防大学国防医学院预防医学研究所詹家琮上校筛选了超过一万个化合物，包括 FDA 通过的药物合成的化合物、传统中草药及其他蛋白酶抑制物等，找到约 50个有效分子可抑制病毒复製，其中 3 个為上市药物。


我们从这些分子证实，由翁主任实验室发展的抗猫爱滋病毒的蛋白酶抑制物 TL-2（图一）也是 SARS 蛋白酶的抑制物。从另一分子库，我们也找到一些含金属离子的化合物及一些红茶裡的多酚类（图一）可有效抑制蛋白酶的活性，也发现一类benzotriazole会和蛋白酶形成紧密的共价物。


当王惠钧所长实验室解开了 SARS蛋白酶的结晶结构后，发现了一个新奇的现象：在原本应该是双体（dimer）的蛋白酶，被周围另一个双体（dimer）的蛋白酶分子将其 C 端（C-terminal）6 个氨基酸插到蛋白酶的中心活性区域，便成 3 个单体蛋白酶的复合体（见图二左）。因此在中间的单体的中心活性区域，便有另一个单体的 N 端及第三个单体的 C端插入。试想 SARS蛋白酶原来本身也包含在多胜肽中，自己必须把自己切出，而切的过程须在 N端及 C端各切一刀，因此难怪 N端及 C端在某些条件下会在蛋白酶的中心活性区域出现。我们也发现在大肠桿菌表现具有 N 端或 C 端切位，但多出一段其它蛋白的蛋白酶，破菌后纯化到的蛋白酶已经切割了切位，可知蛋白酶可藉切自己（auto-processing）而成熟（auto-maturation）且具活性（auto-activation）。 我们另製备没活性、且 N端及 C端都具切位的定点突变蛋白酶 C145A，用成熟的蛋白酶来切它，发现切N端的速度比切 C端快了 55倍，因此我们提出 SARS蛋白酶成熟化的分子机制（见图二右），在此机制中未成熟的长蛋白首先要互相接近然后互切：先切 N端让半成熟蛋白位移（flip）到其 N端，卡入正确位置，再切 C端產生成熟的蛋白。有了 C端镶嵌到活性区域的三度空间结构，我们接著依此结构设计药物，并以先前药厂发展出的 AG7088為出发点。AG7088 為一类胜肽（peptide-like）的鼻病毒 3C 蛋白酶抑制剂，其 P1 位置带有环化的 Gln（此类蛋白酶皆认 P1 上的 Gln），且在 P1’带有会和蛋白酶活性区的 Cys 共价结合的α,β-不饱和双键的酯类（a Michael acceptor），所以可抑制鼻病毒 3C 蛋白酶。但 SARS 蛋白酶和鼻病毒蛋白酶的结构有些不同，所以 AG7088 并不能抑制 SARS蛋白酶，台大方俊民教授实验室便合成了其类似物，由我们来测试其对 SARS蛋白酶的抑制能力註 1，发现在 P1 用 Phe 来取代环化的 Gln 则会產生有抑制活性的分子，从一系列合成的化合物中，我们找到最具抑制能力（Ki = 0.5 µM）的分子為列在图一，但此α,β-不饱和双键的酯类并不会和和蛋白酶活性区的 Cys共价结合，也许是 P1的Phe移位到 P2的结合处，所以 Cys打不到 Michael acceptor。确定了P1要有 Phe，我们又替换了 P1’，发现 2-chloro-4-nitro aniline 在 P1’可使抑制能力大為提升，此名為 anilide化合物也列在图一，具有 Ki = 0.03 µM的效果，而且也在细胞实验发现其具有抵抗病毒的能力。在寻找更有效的抑制物过程中，我们也用电脑模拟以协助改进抑制物。我们同时运用依酵素结构设计出来的药物（rational design）和上述的高通量药物筛选（high throughput screening）作抗SARS药物研发。



以对抗 SARS為目标的团队，除了我们之外还有许多团队，其合作研究规模之大為国内第一遭，事后证明在对抗威胁自身生命财產的疾病上做研究是不容缺席的，在 SARS研究上几个当事的国家都展现其研发实力。笔者认為国内此次 SARS的合作研究模式是成功的。在某些重要领域上，可採取更积极的合作，以產生足够的研发能量，以有限的资源做更有价值的运用。虽说 SARS已经不见，所以药物开发并未到上市阶段，但已经获得一些候选药物，我们也正在利用这些化合物测试对其他有相似蛋白酶的病毒的抑制能力，以期开发出有效的新药。其他如流感病毒、肝炎病毒、爱滋病毒等仍在危害人类的疾病，或许可循此研究模式进行，并开发成商品。



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